Хаберлея родопская (Haberlea rhodopensis) — описание, выращивание, фото

Хаберлея

Хаберлея – Наberlea
Сем. Геснериевые

Хаберлеи — редкие в садоводстве растения. Из двух видов, встречающихся на Балканах, в культуре чаще выращивают один.

Н. rhodopensis (X. родопская) — очаровательное расте­ние с небольшими удлиненными листьями, образующими при­корневую розетку около 15 см в диаметре. Листья зимующие, живут около двух лет. Имеет способность к перенесению за­сухи, почти полностью высы­хая, а затем возрождаясь при увлажнении. Корневая система мочковатая, слабая. Цветет в конце весны — в начале лета. Цветки сиренево-голубые, уд­линенные, до 10 на невысоких голых цветоносах.

Семена чрезвычайно мел­ки и выращивание рассады возможно только в условиях защищенного грунта. Наилуч­ший результат дает высев на рыхлый субстрат, перемешан­ный с крошкой известковых камней. Возможно вегетатив­ное размножение отделением розеток и черенкованием ли­стьев.

Опыт показывает, что почва должна быть кислой, но и на щелочной она растет неплохо. Главное, чтобы была тень и воздух у корней.

Желательна защита от холодных осенних дождей. Лучшее место посадки — слегка притененная щель между кам­нями или плитами стенки сухой кладки или наклонная, хоро­шо дренированная лунка «каменистой горки». Морозостойка, но прикрытие хвойным лапником не помешает. Хаберлеи— истинные «изюминки» каменистого сада, гор­дость коллекционера.

© Сады Северо-Запада.
Это экологический проект.
Помогите ему стать доступным каждому.
При цитировании помещайте активную ссылку
http://sadsevzap.ru или http://сады-севзап.рф

Растения, не образующие почвопокровных куртин. Агротехника

Юрий Марковский
ландшафтный дизайнер и садовод с 33-летним стажем работы в Ботаническом саду РАН, автор книг, статей и лекций по садоводству, Санкт-Петербург

Растения, условно включенные в эту группу, совершенно не схожи и объединены лишь одним признаком: они не разрастаются во все стороны. Основное внешнее сходство видов этой группы — красивая листва, компактность роста, а иногда и красивое цветение.

Для успешного выращивания подобных растений необходимо соблюдать не только конкретные для каждого вида, но и общие для всех травянистых многолетников правила агротехники:

  • Пересадка большинства из них возможна только рано весной, до начала активного роста, или во второй половине лета, после его окончания.
  • При весенней пересадке необходима обрезка плохих и слишком длинных корней, а при осенней — и части побегов. Старые экземпляры необходимо поделить.
  • На одном месте без пересадки растения следует держать до тех пор, пока у них не станет заметной ущербность роста или цветения. Эти признаки могут быть следствием плохого ухода, старения или болезни.
  • Большинство растений предпочитает легкие, богатые гумусом суглинки с кислотностью в пределах рН 5,5 — 6,5.
  • Семенное размножение сугубо индивидуально, но для многих из них рекомендуется стратификация — прием, обеспечивающий подготовку семян к прорастанию. Наиболее простой способ стратификации травянистых многолетников — посев семян с последующим содержанием посевов при ровной влажности и температуре в течение одного — трех месяцев. Для холодной стратификации пред- почтителен диапазон температур от +1 до +5°С, а для теплой — около +20°С. После стратификации семена прорастают чаще всего на свету при температуре + 18 — 25°С.
  • Для лучшего развития рассады большинству из них требуется пикировка — рассаживание молодых сеянцев в стадии семядольных листьев или первого листа. Скальные растения, чаще всего имеющие стержневой корень и не любящие пересадку, желательно распикировывать в горшки и высаживать на постоянное место с комом земли.
  • Многолетники, имеющие «кустовой» тип роста, легко размножаются прикорневыми черенками — побегами весеннего прироста, срезанными от корневища. До наступления цветения такие виды можно размножать и стеблевыми черенками.
  • Условия успешного укоренения: высокая влажность воздуха, умеренная влажность субстрата и ровная температура в пределах 20-25°С. Субстрат для черенкования должен быть рыхлым и чистым. Основным компонентом служит крупный песок. В качестве добавок (1:2 — 1:3) используют верховой торф, мох-сфагнум, кокосовую стружку, перлит и т.п. Укоренение можно про­водить в открытом грунте на специально подготовленных грядах, прикрытых полиэтиленовой пленкой.
  • Осенью все многолетники, не сохранившие или необразовавшие к этому времени зеленых побегов, необходимо обрезать на уровне земли.
  • Для успешной зимовки рекомендуется профилактическое окучивание или мульчирование. Наиболее капризные виды можно прикрыть слоем древесного листа на высоту 10-20 см. Формы с зимующими листьями укрывают хвойным лапником или иным сухим способом.

Создаём красивую альпийскую горку своими руками

Каменистый теневой сад хорош тем, что его создатель может позволить себе больше вольностей, чем в солнечном. В нем используют не только альпийские растения, но и традиционно выращиваемые в цветниках — от соседства с камнем они только выиграют. «Теневики» рыхлее, крупнее солнцелюбивых растений, они чаще всего листопадные или эфемероиды, не образуют вечнозеленых подушек. Но не стоит увлекаться посадкой в

тени среди камней обычных клумбовых многолетников: для чего тогда вообще сооружать горку? Еще один подвох обычно заключается в размере: традиционные культуры слишком велики для альпинария, они активно разрастаются и закрывают собой камни, лишая затею красоты и смысла.

Конструкция горки

Наиболее важен в теневом альпинарии, конечно, камень — он должен превалировать или быть с растениями наравне, создавая фон и оттеняя цвет листвы и цветков. Для этого камни должны возвышаться хотя бы над частью растений. И не за счет перепада высоты, а за счет размера многолетников: чем они ниже, тем более впечатляющим будет общий ансамбль. Важно выбрать направление слоев породы и придерживаться его, а пространство между камнями заполнять рыхлой влагоемкой водопроницаемой почвой. Горку лучше делать пологой — это более естественно для тени, ведь скальные отвесные выступы в природе обычно обнажены и открыты солнцу.

Выбор многолетников

В любом саду мы в первую очередь обращаем внимание на яркие цветки. Но цветение приходится на весну и начало лета, затем краски затухают, уступая место зелени. В тени особенно важно играть с фактурой листвы и ее цветом, ведь летом и осенью ярко цветущих растений для тени гораздо меньше, чем для солнца. Здесь на помощь создателю теневой горки придут, безусловно, хосты. Миниатюрные и вариегатные сорта будто подсвечивают тень. Для контраста формы листвы можно использовать и другие декоративнолистные многолетники: карликовые папоротники, низкорослые астильбы, дицентры.

Многолетники для теневого каменистого сада

• Хоста (Hosta) `Blue Mouse Ears`
• Хоста (Hosta) `Corkscrew`
• Дицентра (Dicentra) `Burning Hearts`, `King of Hearts`
• Астильба простолистная (Astilbe simplicifolia) `Sprite`
• Сорта печеночницы благородной (Hepatica nobilis)
• Печеночница трансильванская (Hepatica transilvanica)
• Вудсия многорядниковая (Woodsia polystichoides)
• Вудсия северная (Woodsia ilvensis)
• Сольданелла горная (Soldanella montana)
•Сорта горянки Юнга (Epimedium х youngianum) `Roseum`, `Niveum`
• Башмачок крупноцветковый (Cypripedium macranthum)
• Башмачок вздутый (Cypripedium ventricosum)
• Сорта венериных башмачков (Cypripedium calceolus), например, `Sabine`
• Горечавка китайская украшенная (Gentiana sino-ornata)
• Осока горная (Carex montana)
• Триллиум крупноцветковый и его махровая форма (Trillium grandiflorum f. flore pleno)
• Триллиум желтый (Trillium luteum)
• Триллиум снежный (Trillium nivale)
• Джефферсония сомнительная (Jeffersonia dubia)
• Анемона дубравная (Anemone nemorosa) `Vestal`
• Сангвинария канадская махровая (Sanguinaria canadensis f. flore pleno)
• Вульфения каринтийская (Wulfenia carinthiaca)
• Рябчик камчатский (Fritillaria camschatcensis) и другие невысокие лесные рябчики
• Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis)

Выбор деревьев и кустарников

Особенно важен подбор хвойных, ведь большинство из них светолюбивы. В сильном затенении могут красоваться лишь тсуги канадские, тиссы канадский и остроконечный. В полутени будут хороши туи западные, ели обыкновенные, некоторые пихты и мож-жевельники, микробиота перекрестнопарная. Стоит использовать карликовые сорта, а не видовые растения, которые слишком велики и годятся в очень ограниченном количестве для заднего плана. Желтохвойные сорта в тени потеряют яркость, будут иметь светло-зеленую окраску. Если горка затенена высокими лиственными деревьями, важно вовремя убирать с хвойных опавшую листву, чтобы не провоцировать их подопревание и грибные болезни. Безусловные фавориты теневой горки — рододендроны, их низкорослые виды и сорта. На заднем плане можно высадить высокие листопадные кусты из группы Knap Hill Hybrid (например, `Nabukko` или Parkfeuer`), а ближе сорта рододендрона плотного или рододендрон золотистый. Их можно использовать на горках, сложенных из любой породы, кроме известняка.

Уход

Уход за теневым альпинарием представляется более простым, чем за солнечным. В нем важную роль играет мульча. Только в тени можно использовать как минеральные компоненты, так и органические. Безусловно, дробленый камень, из которого сложена горка, будет идеальным. Но лиственный опад и увядающие на зиму растения будут забивать такую мульчу и требовать постоянной, пару раз в сезон, подсыпки. Мульчу из коры или щепы, конечно, тоже добавляют, но органические остатки на ней выглядят более естественно. Мульчирование необходимо для сохранения влаги в почве, оно на порядок сокращает необходимость прополки, делает горку аккуратной, оттеняет зелень. Самосев сорняков гораздо меньше из-за тени, а мульча и вовсе сведет его на нет. Останется лишь полив, подкормки да своевременная уборка — срезка стеблей на зиму.
С особой осторожностью нужно относиться к посадке на горке почвопокровных ползучих агрессивных растений и тех, кто дает обильный самосев. Такие «жители» первое время будут ограничены камнями, но быстро находят лазейки и начинают забивать более деликатных соседей. Вероника ползучая, пролеска сибирская, фиалка сестринская, барвинок малый не должны попасть на вашу горку! Иначе они заполонят ее всю.

Рекомендуемые виды и сорта древесных растений

  • Ель обыкновенная (Picea abies) `Formanek` — плакучий сорт, «стекающий» по камням. `Vermont Gold` -желтохвойный сорт, сохраняет желтизну и в затенении.
  • Тсуга канадская (Tsuga canadensis) `Minuta`, `Jeddeloh`, `Nana` — карликовые сорта для переднего плана.
  • Тисе ягодный (Taxus baccata) `Amersfoort` — растение со временем станет довольно большим, но нарастает медленно. Можно стричь.
  • Туя западная (Thuja occidentalis) Maloniana Holub` -растение изумительной графики ветвей.
  • Туя западная (Thuja occidentalis) `Danica` — зеленый правильный «шарик» с довольно медленным ростом.
  • Сосна мелкоцветковая (Pinus parviflora) Fukai` — у этого сорта восхитительно красивая полосатая хвоя, к тому же пятихвойные сосны более теневыносливы.
  • Микробиота перекрестнопарная (Microbiota decussata) Variegata` — размер и характер роста у этого сорта такой же, как и у видового растения, но его украшают вариегатные пряди. Можно держать в рамках дозволенного жесткой обрезкой.
  • Рододендрон плотный (Rhododendron impeditum) `Ramapo` — украсит альпийскую горку вечнозеленым низкорослым кустом и сиренево-синими цветками.
  • Рододендрон руссатум (Rhododendron russatum) Compactum` — похож на предыдущий сорт. Цветки, пожалуй, самые синие из всех сортов рододендронов.
  • Рододендрон золотистый (Rhododendron aureum).

Haberlea Species

Haberlea rhodopensis

Family: Gesneriaceae (ges-ner-ee-AY-see-ee) (Info)
Genus: Haberlea (ha-BUR-lee-uh) (Info)
Species: rhodopensis (roh-doh-PEN-sis) (Info)
Synonym: Haberlea ferdinandi-coburgii

Category:

Alpines and Rock Gardens

Water Requirements:

Average Water Needs; Water regularly; do not overwater

Sun Exposure:

Foliage:

Foliage Color:

Height:

under 6 in. (15 cm)

Spacing:

12-15 in. (30-38 cm)

Hardiness:

USDA Zone 5a: to -28.8 °C (-20 °F)

USDA Zone 5b: to -26.1 °C (-15 °F)

USDA Zone 6a: to -23.3 °C (-10 °F)

USDA Zone 6b: to -20.5 °C (-5 °F)

USDA Zone 7a: to -17.7 °C (0 °F)

USDA Zone 7b: to -14.9 °C (5 °F)

USDA Zone 8a: to -12.2 °C (10 °F)

USDA Zone 8b: to -9.4 °C (15 °F)

USDA Zone 9a: to -6.6 °C (20 °F)

USDA Zone 9b: to -3.8 °C (25 °F)

USDA Zone 10a: to -1.1 °C (30 °F)

USDA Zone 10b: to 1.7 °C (35 °F)

Where to Grow:

Danger:

Bloom Color:

Bloom Characteristics:

Bloom Size:

Bloom Time:

Late Spring/Early Summer

Other details:

Soil pH requirements:

6.1 to 6.5 (mildly acidic)

6.6 to 7.5 (neutral)

Patent Information:

Propagation Methods:

By dividing rhizomes, tubers, corms or bulbs (including offsets)

From leaf cuttings

From seed; sow indoors before last frost

Seed Collecting:

Allow pods to dry on plant; break open to collect seeds

Gardeners’ Notes:

On Sep 4, 2008, altagardener from Calgary, AB (Zone 3b) wrote:

Hardy in zone 3; Calgary, Alberta.

On Jan 18, 2007, bluespiral from (Zone 7a) wrote:

If you are aching to grow this plant on a budget, following are some excellent seed propagation guidelines for the adventurous:

1) Tom Cothier method – Sow at 20*C (68*F); if no germination in 3 – 4 wks, move to -4*C to +4*C (24*F – 39*F) for 2 – 4 wks. Small seed, do not cover

2) from 2nd edition of Norman C. Deno’s book, Seed Germination Theory and Practice: (The following is a shortened paraphrase, heavy with quotes, from Deno’s book, p. 55 – 57. There is much more useful information in that chapter, not to mention the rest of the book – extremely worthwhile to acquire).

Because the roots of Haberlea rhodopensis are fatally susceptible to drying out, due to their tiny size, the pot they are sown in . read more should be placed in a baggy, which can be left for a year, checking every two months for any accidental puncture during which seedlings could dry out.

But first! “. sow the [tiny]. seeds directly in pots on top [do not cover] of surface sterlized soil and enclose immediately in. baggie. [to] insure constant and lightly moist conditions. [S]urface sterlize. the medium by pouring boiling water over the medium three times allowing to drain each time [and cool before sowing]. [Deno prefers the] commercial product Baggies. because the polyethylene film is thin and allow[s] significant diffusion of oxygen into the bag. The Baggie is closed at the top with a wire Twistem, but not so tightly as to totally seal the bag since aerobic conditions must be maintained.”

“Pots enclosed in a Baggie MUST ALWAYS BE KEPT UNDER FLUORESCENT LIGHTS AND NEVER EXPOSED TO DIRECT SUNLIGHT. Due to “the wave-length of . sunlight [and] tungsten filament lights. seedlings [can be cooked in as little as 30 minutes]. At the time he wrote this edition, Deno was using “plain daylight reading type fluorescent lights. [which were] connected through a timer. set to give twelve hours of light and twelve hours of dark.”

Deno says that this method also works well for “other Gesneriads such as Briggsia, Jankae and Ramonda.”

On Apr 4, 2005, Todd_Boland from St. John’s, NL (Zone 5b) wrote:

This hardy member of the African Violet family is native to Greece. It can take to zone 5 if the crown is kept dry in the winter. They need well-drained soil and are best grown vertically in a stone wall. The flowers are like a tubular African Violet in shades of pink or purple-lavender. Lovely plant for an alpine house as well.

Суперкарлики для альпинария

Романда, хаберлея, янкея — представители семейства геснериевых (Gesneriaceae). Они крайне редко встречаются как в природе,так и у любителей дикорастущей флоры. Узкий ареал и медленное вегетативное размножение препятствует их распространению.

Род рамонда (Ramonda) включает в себя три вида, произрастающих в основном в Центральной и Южной Европе в горах на известняковых почвах. Чаще всего встречается рамонда пиринейская или миконская(Ramonda pyrenaica=R.myconi).описанная впервые в 1604 году.Изредка в Пиринеях попадаются популяции этих растений.Они селятся в расщелинах скал и небольших углублениях,где во время дождей скапливается вода,хотя рамонда хорошо переносит и недостаток влаги.

От холодных ночей,обычных в горах,её защищает бархатистое опушение,с обеих сторон покрывающее почти круглые(5 х 4 см),слегка гофрированные листья с зубчатым краем.Они собраны по 10-12 штук в розетку диаметром 11-18 см и высотой около 2 см.За сезон прибавляется 2-4 листа и столько же отмирает старых,лежащих на поверхности почвы.

Цветёт рамонда пиринейская с июня по июль.На тёмно-буром опушённом цветоносе высотой 5-7 см обычно бывает 2-4 сине-фиолетовых цветка с желтовато-зелёным центром с оранжевыми тычинками.После цветения 5-лепестковый венчик опадает.Созревшая семенная коробочка бурого цвета,около 2 мм в диаметре.

Ещё более редка рамонда Наталии(Ramonda nataliae),впервые описанная в 1898 году.Она произрастает на известняковых почвах в Македонии и на Балканах.Цветки белые или лавандово-голубые,с ярко-жёлтыми тычинками.

Романда сербская(Ramonda serbica),описанная в 1855 году,встречается в горах Македонии и Албании.Растёт только на известняках.Отличается от вышеназванных видов синими цветками с пурпурными тычинками.

У каждой из рамонд известны альбиносные и розовые формы.

Род хаберлея(Haberlea)очень близок к предыдущему.Хаберлея родопская(Haberlea rhodopensis)описана в 1881 году.Родина её Балканы,каменистые склоны гор Болгарии.Листья более удлинённые,чем у рамонды ,с округлыми зыбцами и редким опушением.Они собраны в розетки,достигающие 20 см в диаметре.На невысоком цветоносе раскрывается от 1 до 4 синих или розовых цветков с удлинённым в виде небольшой трубочки венчиком с 4-5 зубцами.

Хаберлея Фердинанда-Кобургского(Haberlea ferdinandi-coburgi) была описана в 1911 году.Встречается в горах на севере Болгарии.Опушение на листьях отсутствует,они мелкие и гладкие.Цветки голубые.

Представитель ещё одного близкого рода-янкея Хельдриха(Jankaea heldreichii),описана в 1851 году.Встречается на известняковых скалах Фессалии(Греция) и на легендарной горе Олимп.

В альпинарии эти растения следует сажать на слегка затенённых местах,лучше восточной ориетации.Очень хорошо смотрятся они на фоне серых или серовато-розоватых гранитных валунов округлой формы.

Почву для посадки готовят из равных частей дерновой и листовой земли, разложившегося торфа,мелких камушков и дроблённого красного кирпича.Растения сажают так,чтобы нижние листья розетки касались почвы, и поливают.Землю под ними закрывают тонкими плоскими осколками гранита.Растения можно не пересаживать 4-7 лет.

В засушливое время(особенно весной)все эти виды необходимо несколько раз полить.Пред цветением их можно немного подкормить калийными и фосфорными удобрениями.Азотные применять не следует,так как растения начнут жировать и зимой могут выпасть.Иногда большой вред им наносят капустная и огородная совки.Поэтому весной в качестве профилактики проводят опрыскивание децисом или»интавиром».

С наступлением устойчивых холодов растения укрываю лапником.Это делаю главным образом для того,чтобы уберечь от мышей,так как к морозам эти растения устойчивы.

Подобно многим геснериевым рамонда,хаберлея и янкея размножаются дочерними розетками,весенним черенкованием листьям и семенами.От материнского экземпляра,не выкапывая его,осторожно отделяют отпрыски,засыпая места срезов древесным углём.Сажают их на заранее приготовленное место,выдерживая расстояние между растениями около 10 см.

Весной для черенкования бритвой срезают листья с максимально длинными черешками.Места срезов присыпают молотым углём.Черенки помещают в маленький парник в смесь равных частей крупнозернистого песка и разложившегося торфа.Листья заглубляют на всю длину черешка,располагая наклонно.Посадки регулярно увлажняют.Черз 30-40 дней появляются корни и формируется миниатюрная розетка.Старый лист не удаляют до осени.На следующий год перезимовавшую розетку можно пересадить на постоянное место.

Интересно получить растения семенным путём.У рамонды семена образуются в июле-начале августа.Важно не пропустить момент раскрытия коробочек,иначе высыпавшиеся мелкие семена будет невозможно найти.Сеют их в глиняные горшочки с песчано-торфянистым субстратом,слегка присыпая лиственной землёй,поливают и накрывают стеклом.Когда появятся всходы,стекло постепенно сдвигают,а затем снимают совсем.В первый год сеянцы очень малы и нуждаются в особом внимании,поэтому лучше держать их дома.Зимой поливают очень осторожно,а горшки помещают ближе к окну,где температура держится около 10-12 градусов.

Весной полив увеличивают только тогда,когда будет явно заметен рост листьев.Так же постепенно растения приучают в яркому весеннему солнцу,а в мае их переносят на постоянное место в саду.В дальнейшем уход за сеянцами такой же,как и за взрослыми растениями.

Влияние экстракта габерлеи родопской in vitro на мононуклеарные клетки периферической крови человека Текст научной статьи по специальности « Фундаментальная медицина»

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Петрова-Тачева Веселина Христова

Введение. Габерлея родопская ( Haberlea rhodopensis Friv., HR) многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства D >МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим . Материал и методы. Способ получения экстракта листьев габерлеи: предварительно высушенные и измельченные листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов с последующей дистилляцией спирта в вакуумном испарителе до соотношения сырья/жидкой фазы 1:1. Мононуклеарную фракцию клеток выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Выделенные клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи в течение 12 ч. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций 65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл и контроль без экстракта. Результаты. У становлено, что экстракт габерлеи вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре. Вычислена IC50=10,4 мкл/мл в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим .

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Петрова-Тачева Веселина Христова

INFLUENCE OF HABERLEA RHODOPENSIS IN VITRO ON HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS

Introduction. Haberlea rhodopensis ( Haberlea rhodopensis Friv, HR.) is a perennial plant of the family Gesneriaceae, subfamily D >haberlea rhodopensis in vitro extract in a culture of peripheral blood mononuclear cells by MTT-test and trypan blue exclusion assay. Material and methods. A method for preparing an extract of haberlea leaves: pre-dried leaves are crushed and macerated with ethanol 70 % during 48 hours followed by distillation of the alcohol in a vacuum evaporator to a drug / liqu >trypan blue staining .

Текст научной работы на тему «Влияние экстракта габерлеи родопской in vitro на мононуклеарные клетки периферической крови человека»

МЕДИЦИНА И ФАРМАКОЛОГИЯ

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ГАБЕРЛЕИ РОДОПСКОИ IN VITRO НА МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ крови человека

Петрова-Тачева Веселина Христова

ассистент кафедры молекулярной биологии, иммунологии и медицинской генетики, Тракийский университет, 6000, Болгария, г. Стара Загора, ул. Армейска 11

E-mail: vesepetr@abv. bg

INFLUENCE OF HABERLEA RHODOPENSIS IN VITRO ON HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS

Assistant of Molecular Biology, Immunology and Medical Genetics Chair, Trakia University, 6000, Bulgaria, Stara Zagora, Armeyska Street, 11

Введение. Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis Friv., HR) -многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства Didymocarpeae. Этот вид – реликт доледниковой эпохи, а также и балканский эндемичный вид, распространённый в Болгарии, прежде всего в лесах Родопы и в некоторых областях Старой планины. Установлено, что тотальный экстракт габерлеи проявляет антибактериальную, антикластогенную, антигенотоксичную и антиоксидантную активность.

Цель данного исследования – сравнительное исследование цитотоксичности тотального экстракта из габерлеи родопской in vitro в культуре мононуклеарных клеток периферической крови методом МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим.

Петрова-Тачева В.Х. Влияние экстракта Габерлей Родопской in vitro на мононуклеарных клеток периферической крови человека // Universum: Медицина и фармакология : электрон. научн. журн. 2016. № 5 (27) . URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/3198

Материал и методы. Способ получения экстракта листьев габерлеи: предварительно высушенные и измельченные листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов с последующей дистилляцией спирта в вакуумном испарителе до соотношения сырья/жидкой фазы 1:1. Мононуклеарную фракцию клеток выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Выделенные клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи в течение 12 ч. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций – 65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл и контроль без экстракта.

Результаты. Установлено, что экстракт габерлеи вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре. Вычислена IC50=10,4 мкл/мл в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим.

Introduction. Haberlea rhodopensis (Haberlea rhodopensis Friv, HR.) is a perennial plant of the family Gesneriaceae, subfamily Didymocarpeae. This type is a relic of the pre-glacial era, as well as Balkan endemic species, common in Bulgaria, especially in the forests of the Rhodope and in some areas of Stara Planina. It is found that the total extract of haberlea exhibits antibacterial, anticlastogenic, antigenotoxic and antioxidant activity.

The aim of research – a comparative study of the cytotoxicity of total haberlea rhodopensis in vitro extract in a culture of peripheral blood mononuclear cells by MTT-test and trypan blue exclusion assay.

Material and methods. A method for preparing an extract of haberlea leaves: pre-dried leaves are crushed and macerated with ethanol 70 % during 48 hours followed by distillation of the alcohol in a vacuum evaporator to a drug / liquid phase proportion of 1: 1. Mononuclear cell fraction is isolated from the blood of seven healthy people of both sexes aged 22 to 40 years old by density gradient

centrifugation Histopaque®-1077. The isolated cells are cultured in RPMI-1640 medium supplemented with L-glutamine, 10 % fetal bovine serum, 1 % by volume of a mixture of antibiotics and antimycotics and haberlea plant extract during 12 hours. To study the action of the extract, 5 concentrations are used – 65 mcl/ml, 26 mg/ml, 13 mg/ml, 1.3 mg/ml, 0,13 mg/ml, and control without extract.

Results. It was established that the haberlea extract causes a dose-dependent response of cells in culture. IC50 = 10,4 mcl / ml is calculated in the test on the survival with trypan blue staining.

Ключевые слова: габерлея родопская, МТТ-тест, окраска трипановым синим.

Keywords: haberlea rhodopensis; МТТ-test; trypan blue staining.

Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis Friv., HR) – многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства Didymocarpeae. Этот вид – реликт доледниковой эпохи, а также и балканский эндемичный вид, распространённый в Болгарии, прежде всего в лесах Родопы и в некоторых областях Старой планины. HR относится к так называемым resurrection plants -«воскреснувшим», или восстанавливающимся растениям.

При неблагоприятных внешних условиях выпадает в анабиоз (до 31 месяца), но при наступлении благоприятных условий жизни снова возобновляет свои жизненные процессы [1, с. 150].

HR в последние годы усиленно изучается. Из экстрактов HR обнаружены гликозиды муконозид и паусцифлосид, хиспидулин С-гликозиды, аминокарбоновые кислоты, жирные кислоты, феноловые кислоты (сиринговая кислота, ванилиновая кислота, кофейная кислота, дигидрокофейная кислота и др.), фитостеролы, глицериды и др. [7, с. 21; 8, с. 38; 9, с. 215]. Несколько групп ученых нашего института тоже исследовали габерлею. На белых лабораторных мышах была изучена острая и хроническая токсичность

тотального экстракта. Была определена ЛД50=14,8 ml/kg для мышей при внутрибрюшинном введении [6, с. 78]. Обнаружена антибактериальная активность [10, с. 34], антикластогенная, антигенотоксичная и антиоксидантная активность тотального экстракта HR [6, с. 199-200].

Прежде чем продолжить дальнейшее изучение биологических активности экстракта и его молекулярных и клеточных механизмов, важно изучить и его цитотоксичность. Проявления токсического процесса на клеточном уровне сказывается структурно-функциональными изменениями клетки (изменение формы, сродства к красителям, подвижности и т. д.), преждевременной гибелью клетки (некроз, апоптоз) и мутациями (генотоксичность) [5, с. 119]. Модели in vitro с использованием культур клеток и биохимических показателей на клеточном уровне все более применяется в биохимико-токсикологических исследованиях. Они имеют ряд преимущества: более дешевые; привлекательные с этической точки зрения, поскольку они существенно уменьшают использование животных [4, с. 256]. Работа непосредственно на культурах клеток человека делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека, преодолевая значительное количество видовых различий в метаболизме. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные синергетические и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений [2, с. 3]. Кроме того, известно, что первичные клеточные культуры имеют морфологические и биохимические характеристики ближе всего к исходному органу или ткани, и они более чувствительны к воздействиям токсичных веществ по сравнению с клеточными линиями [11, с. 78].

Поэтому, а также в связи с актуальностью исследований действия HR на клеточном уровне, в качестве объекта нашего исследования мы выбрали мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови человека.

Цель работы – сравнительное исследование цитотоксичности тотального экстракта из габерлеи родопской in vitro в культуре мононуклеарных клеток

периферической крови методом МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим.

Материалы и методы исследования

Экстракт и реактивы. Тотальный экстракт листьев габерлеи был любезно предоставлен доцентом Б. Поповым. Предварительно высушенные и измельченные до порошкообразного состояния листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов. Затем спиртовую и основную часть водной фаз отгоняли в вакуумном испарителе до соотношении сырья/жидкой фазы 1:1. Определённое количество экстрагированных веществ составляло 100 мг/мл [6, с. 74-75].

Histopaque®-1077, питательная среда RPMI-1640, термоинактивированная фетальная телячья сыворотка (ФТС), смеси антибиотиков и антимикотиков, МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) и краситель трипановый синий были приобретены у компании Sigma Aldrich.

Выделение и культивирование клеток. Мононуклеарную фракцию клеток (моноциты и лифоциты) выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет. Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Затем МНК культивировали в культуральных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций -65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл, и контроль без экстракта. Клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере с 5 % СО2 в течение 12 ч. После 12 ч. инкубации их тщательно троекратно промывали фосфатным буфером путем центрофугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Затем проводили МТТ- тест и тест на выживаемость при окраске трипановым синим.

МТТ-тест Принцип теста основан на способности митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных клеток конвертировать водорастворимый МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) в нерастворимое

вещество – формазан, имеющий вид синих кристаллов, которые потом растворяются с помощью органических растворителей и отсчитываются фотометрием. Для проведения теста в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 100 мкл из каждой клеточной культуры, добавляли 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) и инкубировали при 37 °С в течение 3 ч. После инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл закисленного изопропанола (0,04 N HCl в абсолютном изопропаноле). Оптическую плотность растворов затем определяли на планшетном ридере Мультискан ЕХ (Термо Электрон, Германия) при длине волны 570 нм и 620 нм. Процентное содержание живых клеток вычисляли по формуле: (0Пэкс/0Пконтр)х100, где ОПэкс – оптическая плотность экспериментальной лунки, ОП контр – оптическая плотность контрольной лунки.

Тест на выживаемость при окраске трипановым синим. Этот тест учитывает лишь состояние цитоплазматической мембраны – интактна она или повреждена. Его проводили по методикам, описанным в книге «Лимфоциты. Методы» [3, с. 50]. В лунку панели для микротитрования вносили равные объемы (по 10 мкл) клеточной суспензии и 0,4 % раствора трипаного синего. Ресуспендировали клетки пипетированием и вводили клеточную взвесь в гемоцитометрическую камеру. Затем подсчитывали не менее 100 клеток, отмечая голубые (погибшие) и неокрашенные (живые).

Статистический анализ. Результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для оценки статистической достоверности различий между соответственными средними значениями использовали непараметрический дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса. За достоверные принимали различия средних величин при р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рисунок 1. Эффект экстракта габерлеи на культурах мононуклеарных

клеток периферической крови

Величины обоих тестов (МТТ-тест и тест на выживаемость при окраске трипановым синим) хорошо совпадают и между ними нет статистически значимой разницы (р>0,05).

Результаты исследования показали, что экстракт вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре – тенденция к увеличению цитотоксического эффекта ИЯ повышением концентраций (рис. 1). Величины контрольных проб и этих при концентрации 0,13 мкл/мл экстракта близки и не имеют статистически достоверной разницы (р>0,05). Была определена 1С50 (средняя ингибиторная концентрация) в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим, которая составляла приблизительно 10,4 мкл/мл. В диапазоне концентраций ИЯ от 0 до 26 мкл/мл в МТТ-тесте вычисленная 1С50 была 9,75 мкл/мл. Наблюдаемое статистически достоверное отклонение от общей тенденции проявлялось лишь при высоких показателях МТТ-теста при концентрации 65 мкл/мл экстракта. Они, конечно, могут быть обусловлены селективным ингибированием митохондриальных дегидрогеноз в меньше степени при этой концентрации, но для более точной интерпретацией необходимо проведение более широкого исследование.

Проведено сравнительное изучение цитотоксического влияния экстракта из листьев габерлеи родопской in vitro на мононуклеарные клетки периферической крови человека в диапазоне концентраций от 0,13 до 65 мкл/мл. Полученные результаты углубляют и расширяют представление о влиянии тотального экстракта листьев габерлеи родопской и имеют практическое значение для специалистов, изучающих биологические эффекты растительных экстрактов in vitro и их молекулярные и клеточные механизмы воздействия в условиях in vitro.

1. Георгиева С.Й. Лучезащитный и антигенотоксичный потенциал растительных экстрактов и природных продуктов. – Ст. З.: КОТА, 2013. -150 с.

2. Еропкин М.Ю. Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследования: автореф. дис. . канд. биол. наук. -СПб., 2004.

3. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы. – М.: Мир, 1990.

4. Конки Д., Эрба Э., Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. – М.: Мир, 1989.

5. Куценко С.А. Основы токсикологии / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.medline.ru/public/monografy/toxicology/p1-preface/pl.phtml (дата обращения: 07.04.2016).

6. Попов Б.Н. Антимутагенный потенциал тотального экстракта Haberlea Rhodopensis: дис. . канд. биол. наук. – Ст З., 2011.

7. Радев Р. Фармакологические эффекты фенилэтаноидных гликозидов // JCM. – 2010. -Vol. 2, № 1. – С. 20-23.

8. DGC-MS profiling of bioactive extracts from Haberlea rhodopensis: an endemic resurrection plant/ S.Berkov, M. Nikolova, N Hristozova [et al.] // J. Serb. Chem. Soc. – 2011. – Vol. 76, № 2. -P. 211-220.

9. Flavone 8-C-Glycosides from Haberlea rhodopensisFriv. (Gesneriaceae)/ С.Н. Ebrahimi, F. Gafner, G Dell’Acqua [et al.] // Helvetica Chimica Acta. -2011. -Vol. 94, № 1. – P. 38-45.

10. Study of antibacterial activity of Haberlea rhodopensis / R. Radev, G. Lazarova, P. Nedialkov [et al] // Trakia Journal of Sciences. – 2011. – Vol. 7, № 1. -Р. 34-36.

11. Toxicity Tests with Mammalian Cell Cultures. Short-term Toxicity Tests for Non-genotoxic Effects/ B. Ekwall, V. Silano V., A. Paganuzzi-Stammati [et al]. -New York: John Wiley & Sons Ltd. – 1990 – P. 75-98.

1. Georgieva S.I. Ray protective and anti-genotoxic potential of plant extracts and natural products. St. Z., КОТА Publ., 2013. (In Bulgarian).

2. Eropkin M.Iu. The cell cultures as a model system in the bio chemical-toxicological studies. Cand. biol. sci. diss. St. Petersburg, 2004. (In Russian).

3. Klaus Dzh. Lymphocytes. Methods. Moscow, Mir Publ., 1990. (In Russian).

4. Konki D., Erba E., Freshni R. Culture of animal cells. Methods. Moscow, Mir Publ., 1989. (In Russian).

5. Kutsenko S.A. Toxicology basics. Available at: http: //www.medline.ru/public/monografy/toxicology/p 1 -preface/p 1 .phtml (accessed: 07 April 2016).

6. Popov B.N. Antimutagenic potential of total extract Haberlea Rhodopensis. Cand.biol. sci. diss. Art. З., 2011. (In Bulgarian).

7. Radev R. Pharmacological effects of phenyl glycosides etanoid glycosides. JCM, 2010, vol. 2, no. 1, pp. 20-23 (In Bulgarian).

8. DGC-MS profiling of bioactive extracts from Haberlea rhodopensis: an endemic resurrection plant. S.Berkov, M. Nikolova, N Hristozova [et al.]. J. Serb. Chem. Soc. 2011. Vol. 76, № 2. P. 211-220.

9. Flavone 8-C-Glycosides from Haberlea rhodopensisFriv. (Gesneriaceae). C.H. Ebrahimi, F. Gafner, G Dell’Acqua [et al]. Helvetica Chimica Acta. 2011. Vol. 94, № 1. P. 38-45.

10. Study of antibacterial activity of Haberlea rhodopensis. R. Radev, G. Lazarova, P. Nedialkov [et al]. Trakia Journal of Sciences. 2011. Vol. 7, № 1. P. 34-36.

11. Toxicity Tests with Mammalian Cell Cultures. Short-term Toxicity Tests for Non-genotoxic Effects. B. Ekwall, V. Silano V., A. Paganuzzi-Stammati [et al]. New York: John Wiley & Sons Ltd. 1990. P. 75-98.

Влияние экстракта Габерлей Родопской in vitro на мононуклеарных клеток периферической крови человека

Rating Content
Neutral
Цитировать:
Петрова-Тачева В.Х. Влияние экстракта Габерлей Родопской in vitro на мононуклеарных клеток периферической крови человека // Universum: Медицина и фармакология : электрон. научн. журн. 2016. № 5(27). URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/3198 (дата обращения: 11.02.2020).

АННОТАЦИЯ

Введение. Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis Friv., HR) – многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства Didymocarpeae. Этот вид – реликт доледниковой эпохи, а также и балканский эндемичный вид, распространённый в Болгарии, прежде всего в лесах Родопы и в некоторых областях Старoй планины. Установлено, что тотальный экстракт габерлеи проявляет антибактериальную, антикластогенную, антигенотоксичную и антиоксидантную активность.

Цель данного исследования – сравнительное исследование цитотоксичности тотального экстракта из габерлеи родопской in vitro в культуре мононуклеарных клеток периферической крови методом МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим.

Материал и методы. Способ получения экстракта листьев габерлеи: предварительно высушенные и измельченные листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов с последующей дистилляцией спирта в вакуумном испарителе до соотношения сырья/жидкой фазы 1:1. Мононуклеарную фракцию клеток выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Выделенные клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи в течение 12 ч. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций – 65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл и контроль без экстракта.

Результаты. Установлено, что экстракт габерлеи вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре. Вычислена IC50=10,4 мкл/мл в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим.

ABSTRACT

Introduction. Haberlea rhodopensis (Haberlea rhodopensis Friv, HR.) is a perennial plant of the family Gesneriaceae, subfamily Didymocarpeae. This type is a relic of the pre-glacial era, as well as Balkan endemic species, common in Bulgaria, especially in the forests of the Rhodope and in some areas of Stara Planina. It is found that the total extract of haberlea exhibits antibacterial, anticlastogenic, antigenotoxic and antioxidant activity.

The aim of research – a comparative study of the cytotoxicity of total haberlea rhodopensis in vitro extract in a culture of peripheral blood mononuclear cells by MTT-test and trypan blue exclusion assay.

Material and methods. A method for preparing an extract of haberlea leaves: pre-dried leaves are crushed and macerated with ethanol 70 % during 48 hours followed by distillation of the alcohol in a vacuum evaporator to a drug / liquid phase proportion of 1: 1. Mononuclear cell fraction is isolated from the blood of seven healthy people of both sexes aged 22 to 40 years old by density gradient centrifugation Histopaque®-1077. The isolated cells are cultured in RPMI-1640 medium supplemented with L-glutamine, 10 % fetal bovine serum, 1 % by volume of a mixture of antibiotics and antimycotics and haberlea plant extract during 12 hours. To study the action of the extract, 5 concentrations are used – 65 mcl/ml, 26 mg/ml, 13 mg/ml, 1.3 mg/ml, 0,13 mg/ml, and control without extract.

Results. It was established that the haberlea extract causes a dose-dependent response of cells in culture. IC50 = 10,4 mcl / ml is calculated in the test on the survival with trypan blue staining.

Введение

Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis Friv., HR) – многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства Didymocarpeae. Этот вид – реликт доледниковой эпохи, а также и балканский эндемичный вид, распространённый в Болгарии, прежде всего в лесах Родопы и в некоторых областях Старoй планины. HR относится к так называемым resurrection plants – «воскреснувшим», или восстанавливающимся растениям. При неблагоприятных внешних условиях выпадает в анабиоз (до 31 месяца), но при наступлении благоприятных условий жизни снова возобновляет свои жизненные процессы [1, с. 150].

HR в последние годы усиленно изучается. Из экстрактов HR обнаружены гликозиды муконозид и паусцифлосид, хиспидулин С-гликозиды, аминокарбоновые кислоты, жирные кислоты, феноловые кислоты (сиринговая кислота, ванилиновая кислота, кофейная кислота, дигидрокофейная кислота и др.), фитостеролы, глицериды и др. [7, с. 21; 8, с. 38; 9, с. 215]. Несколько групп ученых нашего института тоже исследовали габерлею. На белых лабораторных мышах была изучена острая и хроническая токсичность тотального экстракта. Была определена ЛД50=14,8 ml/kg для мышей при внутрибрюшинном введении [6, с. 78]. Обнаружена антибактериальная активность [10, с. 34], антикластогенная, антигенотоксичная и антиоксидантная активность тотального экстракта HR [6, с. 199–200].

Прежде чем продолжить дальнейшее изучение биологических активности экстракта и его молекулярных и клеточных механизмов, важно изучить и его цитотоксичность. Проявления токсического процесса на клеточном уровне сказывается структурно-функциональными изменениями клетки (изменение формы, сродства к красителям, подвижности и т. д.), преждевременной гибелью клетки (некроз, апоптоз) и мутациями (генотоксичность) [5, с. 119]. Модели in vitro с использованием культур клеток и биохимических показателей на клеточном уровне все более применяется в биохимико-токсикологических исследованиях. Они имеют ряд преимущества: более дешевые; привлекательные с этической точки зрения, поскольку они существенно уменьшают использование животных [4, с. 256]. Работа непосредственно на культурах клеток человека делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека, преодолевая значительное количество видовых различий в метаболизме. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные синергетические и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений [2, с. 3]. Кроме того, известно, что первичные клеточные культуры имеют морфологические и биохимические характеристики ближе всего к исходному органу или ткани, и они более чувствительны к воздействиям токсичных веществ по сравнению с клеточными линиями [11, с. 78].

Поэтому, а также в связи с актуальностью исследований действия HR на клеточном уровне, в качестве объекта нашего исследования мы выбрали мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови человека.

Цель работы – сравнительное исследование цитотоксичности тотального экстракта из габерлеи родопской in vitro в культуре мононуклеарных клеток периферической крови методом МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим.

Материалы и методы исследования

Экстракт и реактивы. Тотальный экстракт листьев габерлеи был любезно предоставлен доцентом Б. Поповым. Предварительно высушенные и измельченные до порошкообразного состояния листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов. Затем спиртовую и основную часть водной фаз отгоняли в вакуумном испарителе до соотношении сырья/жидкой фазы 1:1. Определённое количество экстрагированных веществ составляло 100 мг/мл [6, с. 74–75].

Histopaque®-1077, питательная среда RPMI-1640, термоинактивированная фетальная телячья сыворотка (ФТС), смеси антибиотиков и антимикотиков, МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) и краситель трипановый синий были приобретены у компании Sigma Aldrich.

Выделение и культивирование клеток. Мононуклеарную фракцию клеток (моноциты и лифоциты) выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет. Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Затем МНК культивировали в культуральных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций – 65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл, и контроль без экстракта. Клетки инкубировали при 37 ˚С в атмосфере с 5 % СО2 в течение 12 ч. После 12 ч. инкубации их тщательно троекратно промывали фосфатным буфером путем центрофугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Затем проводили МТТ- тест и тест на выживаемость при окраске трипановым синим.

МТТ-тест. Принцип теста основан на способности митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных клеток конвертировать водорастворимый МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) в нерастворимое вещество – формазан, имеющий вид синих кристаллов, которые потом растворяются с помощью органических растворителей и отсчитываются фотометрием. Для проведения теста в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 100 мкл из каждой клеточной культуры, добавляли 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) и инкубировали при 37 ˚С в течение 3 ч. После инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл закисленного изопропанола (0,04 N HCl в абсолютном изопропаноле). Оптическую плотность растворов затем определяли на планшетном ридере Мультискан ЕХ (Термо Электрон, Германия) при длине волны 570 нм и 620 нм. Процентное содержание живых клеток вычисляли по формуле: (ОПэкс/ОПконтр)x100, где ОПэкс – оптическая плотность экспериментальной лунки, ОП контр – оптическая плотность контрольной лунки.

Тест на выживаемость при окраске трипановым синим. Этот тест учитывает лишь состояние цитоплазматической мембраны – интактна она или повреждена. Его проводили по методикам, описанным в книге «Лимфоциты. Методы» [3, с. 50]. В лунку панели для микротитрования вносили равные объемы (по 10 мкл) клеточной суспензии и 0,4 % раствора трипаного синего. Ресуспендировали клетки пипетированием и вводили клеточную взвесь в гемоцитометрическую камеру. Затем подсчитывали не менее 100 клеток, отмечая голубые (погибшие) и неокрашенные (живые).

Статистический анализ. Результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для оценки статистической достоверности различий между соответственными средними значениями использовали непараметрический дисперсионный анализ Крускала–Уоллиса. За достоверные принимали различия средних величин при р 0,05).

Результаты исследования показали, что экстракт вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре – тенденция к увеличению цитотоксического эффекта HR повышением концентраций (рис. 1). Величины контрольных проб и этих при концентрации 0,13 мкл/мл экстракта близки и не имеют статистически достоверной разницы (р>0,05). Была определена IC50 (средняя ингибиторная концентрация) в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим, которая составляла приблизительно 10,4 мкл/мл. В диапазоне концентраций HR от 0 до 26 мкл/мл в МТТ-тесте вычисленная IC50 была 9,75 мкл/мл. Наблюдаемое статистически достоверное отклонение от общей тенденции проявлялось лишь при высоких показателях МТТ-теста при концентрации 65 мкл/мл экстракта. Они, конечно, могут быть обусловлены селективным ингибированием митохондриальных дегидрогеноз в меньше степени при этой концентрации, но для более точной интерпретацией необходимо проведение более широкого исследование.

Заключение

Проведено сравнительное изучение цитотоксического влияния экстракта из листьев габерлeи родопской in vitro на мононуклеарные клетки периферической крови человека в диапазоне концентраций от 0,13 до 65 мкл/мл. Полученные результаты углубляют и расширяют представление о влиянии тотального экстракта листьев габерлеи родопской и имеют практическое значение для специалистов, изучающих биологические эффекты растительных экстрактов in vitro и их молекулярные и клеточные механизмы воздействия в условиях in vitro.

1. Георгиева С.Й. Лучезащитный и антигенотоксичный потенциал растительных экстрактов и природных продуктов. – Ст. З.: КОТА, 2013. –150 с.

2. Еропкин М.Ю. Культуры клеток как модельная система в биохимико-токсикологических исследования: автореф. дис. . канд. биол. наук. – СПб., 2004.
3. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы. – М.: Мир, 1990.
4. Конки Д., Эрба Э., Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. – М.: Мир, 1989.
5. Куценко С.А. Основы токсикологии / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.medline.ru/public/monografy/toxicology/p1-preface/p1.phtml (дата обращения: 07.04.2016).
6. Попов Б.Н. Антимутагенный потенциал тотального экстракта Haberlea Rhodopensis: дис. . канд. биол. наук. – Ст З., 2011.
7. Радев Р. Фармакологические эффекты фенилэтаноидных гликозидов // JCM. – 2010. –Vol. 2, № 1. – С. 20–23.
8. DGC–MS profiling of bioactive extracts from Haberlea rhodopensis: an endemic resurrection plant/ S.Berkov, M. Nikolova, N Hristozova [et al.] // J. Serb. Chem. Soc. – 2011. – Vol. 76, № 2. –P. 211–220.
9. Flavone 8-C-Glycosides from Haberlea rhodopensisFriv. (Gesneriaceae)/ С.Н. Ebrahimi, F. Gafner, G Dell’Acqua [et al.] // Helvetica Chimica Acta. – 2011. –Vol. 94, № 1. – P. 38–45.
10. Study of antibacterial activity of Haberlea rhodopensis / R. Radev, G. Lazarova, P. Nedialkov [et al] // Trakia Journal of Sciences. – 2011. – Vol. 7, № 1. – Р. 34–36.
11. Toxicity Tests with Mammalian Cell Cultures. Short-term Toxicity Tests for Non-genotoxic Effects/ B. Ekwall, V. Silano V., A. Paganuzzi-Stammati [et al]. – New York: John Wiley & Sons Ltd. – 1990 – P. 75–98.

1. Georgieva S.I. Ray protective and anti-genotoxic potential of plant extracts and natural products. St. Z., КОТА Publ., 2013. (In Bulgarian).

2. Eropkin M.Iu. The cell cultures as a model system in the bio chemical-toxicological studies. Cand. biol. sci. diss. St. Petersburg, 2004. (In Russian).
3. Klaus Dzh. Lymphocytes. Methods. Moscow, Mir Publ., 1990. (In Russian).
4. Konki D., Erba E., Freshni R. Culture of animal cells. Methods. Moscow, Mir Publ., 1989. (In Russian).
5. Kutsenko S.A. Toxicology basics. Available at: http://www.medline.ru/public/monografy/toxicology/p1-preface/p1.phtml (accessed: 07 April 2016).
6. Popov B.N. Antimutagenic potential of total extract Haberlea Rhodopensis. Cand.biol. sci. diss. Art. З., 2011. (In Bulgarian).
7. Radev R. Pharmacological effects of phenyl glycosides etanoid glycosides. JCM, 2010, vol. 2, no. 1, pp. 20–23 (In Bulgarian).
8. DGC–MS profiling of bioactive extracts from Haberlea rhodopensis: an endemic resurrection plant. S.Berkov, M. Nikolova, N Hristozova [et al.]. J. Serb. Chem. Soc. 2011. Vol. 76, № 2. P. 211–220.
9. Flavone 8-C-Glycosides from Haberlea rhodopensisFriv. (Gesneriaceae). С.Н. Ebrahimi, F. Gafner, G Dell’Acqua [et al]. Helvetica Chimica Acta. 2011. Vol. 94, № 1. P. 38–45.
10. Study of antibacterial activity of Haberlea rhodopensis. R. Radev, G. Lazarova, P. Nedialkov [et al]. Trakia Journal of Sciences. 2011. Vol. 7, № 1. Р. 34–36.
11. Toxicity Tests with Mammalian Cell Cultures. Short-term Toxicity Tests for Non-genotoxic Effects. B. Ekwall, V. Silano V., A. Paganuzzi-Stammati [et al]. New York: John Wiley & Sons Ltd. 1990. P. 75–98.

Информация об авторах:

ассистент кафедры молекулярной биологии, иммунологии и медицинской генетики, Тракийский университет, 6000, Болгария, г. Стара Загора, ул. Армейска 11

Assistant of Molecular Biology, Immunology and Medical Genetics Chair, Trakia University, 6000, Bulgaria, Stara Zagora, Armeyska Street, 11

Читайте также:  Вьюнок (Convolvulus) — описание, выращивание, фото
Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Agrian.ru
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: